液相色譜柱色譜柱活化
新的色譜柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過程，活化之前必須查看包裝內(nèi)配套說明書，并按說明書上聯(lián)系方式，與供應(yīng)商核實(shí)色譜柱內(nèi)保存溶劑及推薦活化步驟，若無推薦步驟可參考如下活化步驟：
1. 反相柱活化流程：
①甲醇或乙腈沖洗20倍柱體積;
②若流動(dòng)相含有緩沖鹽，用跟流動(dòng)相中鹽相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗過渡，用量為20倍柱體積，再用含緩沖鹽的流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上;
③若流動(dòng)相不含緩沖鹽，用流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上;
④最終到壓力基線平穩(wěn)，若不平穩(wěn)可延長平衡時(shí)間。
2. 正相柱活化流程：
2.1 保存溶劑為正相溶劑時(shí)：
若使用正相溶劑做流動(dòng)相，可用正相流動(dòng)相沖洗20倍體積。一般先用異丙醇沖洗50倍體積，可用0. 2mL/min流速，再用流動(dòng)相(乙腈/水)平衡50倍體積。
2.2 保存溶劑為反相體系時(shí)：
若使用反相體系做流動(dòng)相，使用反相溶劑沖洗20倍體積后即可使用。若使用正相體系做流動(dòng)相先用異丙醇沖洗50倍體積，可用0. 2mL/min流速，再用正相流動(dòng)相平衡50倍體積。
補(bǔ)充：
柱體積計(jì)算：
例：2. 5mLx-65%（沒有裝填的柱體積）=1. 5mL=1個(gè)柱體積
液相色譜柱的保養(yǎng)
1. 色譜柱應(yīng)輕拿輕放,避免碰撞振動(dòng)，放置和歸還時(shí)，相應(yīng)上機(jī)人員應(yīng)確認(rèn)保存在合適的溶劑中,并確認(rèn)色譜柱兩端的堵頭已旋緊。
2. 色譜柱壓力升高時(shí),應(yīng)按照“標(biāo)題三”步驟進(jìn)行維護(hù)，色譜柱維護(hù)應(yīng)在色譜柱檔案備注中注明。
3. 當(dāng)出現(xiàn)色譜柱峰高降低,峰寬加大或出現(xiàn)肩峰及柱效下降時(shí)。應(yīng)按照“標(biāo)題四”原則進(jìn)行色譜柱再生，色譜柱再生應(yīng)在色譜柱檔案備注中注明。
4. 當(dāng)色譜柱維護(hù)及再生后，柱效、柱壓仍然不滿足要求，則上報(bào)相關(guān)負(fù)責(zé)人，經(jīng)負(fù)責(zé)人評估后認(rèn)為確需報(bào)廢的應(yīng)在色譜柱檔案中做好報(bào)廢記錄，報(bào)廢后的色譜柱應(yīng)專門存放,以便將來可以利用其填料修復(fù)被嚴(yán)重污染的色譜柱。，
色譜柱柱壓上升
1.色譜柱柱壓上升原因分析
和柱壓相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板以及其后面1-2cm長度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：
1.1填料破碎和使用后有填料粉末生成
當(dāng)流動(dòng)相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末時(shí)，會(huì)堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板
1.2顆粒物堵塞引起柱壓上升和對策
可能堵塞進(jìn)口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：樣品（制樣時(shí)灰塵和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動(dòng)相（溶劑本身含有和配制過程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）。
水和緩沖鹽流動(dòng)相內(nèi)生長的細(xì)菌，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。
1.3化學(xué)污染物引起柱壓上升和對策
來源同樣是樣品、流動(dòng)相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染最普遍，特別是對復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時(shí)候。化學(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來源的物質(zhì)。
像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會(huì)在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測器一般對此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為干擾峰、基線波動(dòng)、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰；保留能力中等的污染物，會(huì)被慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動(dòng)和基線緩慢漂移；對強(qiáng)保留的污染物，一般流動(dòng)相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會(huì)逐步在柱頭累積，因此需采取沖洗維護(hù)。
2.色譜柱柱壓上升解決方案
2.1 首先判斷除色譜柱外儀器壓力是否正常，從柱溫箱卸下液相柱，原本接液相柱的位置換成液相兩通，走純水流動(dòng)相，流速1mL/min，首先判斷儀器壓力是否正常（一般安捷倫儀器不會(huì)超過30bar，島津儀器一般不超過4. 0）。
2.2若使用保護(hù)柱，應(yīng)先排除是否保護(hù)柱的問題，可以先去掉或更換新的保護(hù)柱，檢查壓力和柱效的情況。
2.3若儀器除色譜柱外壓力正常，去掉保護(hù)柱后仍存在壓力高、柱效下降等問題時(shí)，首先斷開色譜柱子和檢測器的連接，將管線留在色譜柱末端，將其放入接收液體的燒杯中，用以下步驟沖洗色譜柱：
反向色譜柱：
先用不含緩沖液鹽的流動(dòng)相沖洗〈水/有機(jī)相)，即90%純水/10%有機(jī)相（甲醇或乙腈，分析流速?zèng)_洗）；
50%純水/50%有機(jī)相（分析流速?zèng)_洗）；
純有機(jī)相（甲醇/乙腈，分析流速?zèng)_洗，如果柱效恢復(fù)，則無需下一步?jīng)_洗）；
75%乙腈/25%異丙醇（50%分析流速?zèng)_洗）；
100%異丙醇（異丙醇粘度較大，建議沖洗流速為分析流速五分之一，避免超壓）；
100％二氯甲烷（50%分析流速?zèng)_洗）；
100%正己烷（50%分析流速?zèng)_洗）；
100%異丙醇（使用正己烷后，在使用之前或恢復(fù)使用反相流動(dòng)相之前必須用100%異丙醇進(jìn)行沖洗，必要時(shí)，流速可以再降低，但需要保證沖洗體積）；
乙腈（（先低流速0. 3mL/min沖洗，看壓力平穩(wěn)后，也就是異丙醇被逐漸替換除去，再適當(dāng)?shù)脑黾恿魉俚?mL/min， 需要注意壓力不要驟然升高，替換出異丙醇溶液，接上檢測器，再用流動(dòng)相平衡色譜柱，進(jìn)標(biāo)樣測試峰型）。
每一步?jīng)_洗的目的：高水相沖洗殘留的緩沖鹽，避免后面沖洗有機(jī)相導(dǎo)致鹽析—過渡—純有機(jī)相沖洗反相保留較強(qiáng)的污染物—洗脫能力更強(qiáng)的流動(dòng)相沖洗
注意：
每個(gè)步驟原則上沖洗10-20倍柱體積，可以根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)?shù)脑黾踊蛘邷p少；
② 對于壓力上漲幅度較大或者柱效下降幅度較大（比如50%以上）的問題，且色譜柱粒徑大于1. 8um或1. 9um粒徑的色譜柱，建議直接進(jìn)行反沖處理，色譜柱后端不接檢測器，流出的流動(dòng)相直接進(jìn)廢液,沖洗步驟相同。
甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長菌，使用時(shí)間不可超過3天
舉例：以4. 6*250*5um規(guī)格的PLus/XDB/SB-C18色譜柱為例，操作如下：
1. 90%水10%乙腈，流速1mL/min，沖洗體積：50mL （如果流動(dòng)相或者樣品中水溶性成分或者鹽含量過高，可以適當(dāng)延長沖洗時(shí)間）；
2. 50%水50%乙腈，流速1mL/min，沖洗體積：25mL （過渡）
3. 100%乙腈，流速1mL/min，50mL （如果樣品或者污染物中反相保留的化合物含量過高，可以適當(dāng)延長沖洗時(shí)間）；
4. 75%乙腈/25%異丙醇，流速0. 5mL/min，沖洗25mL（過渡）；
5. 100%異丙醇 ，流速0. 3mL/min，50mL （以上兩步?jīng)_洗效果不佳的情況下，嘗試異丙醇沖洗）；
6. 100%正己烷，流速0. 5mL/min，沖洗25mL
7. 100%異丙醇，流速0. 3mL/min，沖洗25mL
8. 100%乙腈，流速0. 3mL/min~1 mL/min，沖洗25~50mL
附：對于蛋白質(zhì)污染反相色譜柱的清洗方法
蛋白污染： 三氟乙酸可以降低流動(dòng)相的 pH，抑制酸性硅醇基的解離，同時(shí)可作為離子對試劑，與蛋白的結(jié)合，抑制 與硅膠基質(zhì)的次級作用，所以當(dāng)?shù)鞍孜廴旧V柱時(shí)，可考慮用以下方式?jīng)_洗： 流動(dòng)相： A 0. 1%TFA， B 0. 1%TFA 乙腈 梯度： 30min B 由 10%上升至 100%，保持 10min 樣品： DMSO，進(jìn)樣量 20uL 流速：分析流速 以 DMSO 作為樣品，用梯度的方式?jīng)_洗色譜柱，建議重復(fù) 5 個(gè)循環(huán)。
正相色譜柱（暫時(shí)只針對氨基柱）：
100%乙腈，流速1mL/min，沖洗5倍柱體積
100%異丙醇，流速0. 3mL/min，沖洗5倍柱體積
50%乙腈水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗5倍柱體積
含0. 1%EDTA的水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗10倍柱體積
0. 2MoL醋酸銨水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗20倍柱體積
50%乙腈水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗5倍柱體積
100%乙腈，流速1mL/min，沖洗10倍柱體積，封存
色譜柱一般流速推薦：4. 6mm內(nèi)徑柱子，柱流速：1mL/min左右；3. 0mm內(nèi)徑柱子，柱流速：0. 5mL/min左右；2. 1mm內(nèi)徑柱子，柱流速：0. 2mL/min左右。（注意：不要超過色譜柱最高耐受壓力）
三、液相色譜柱再生
當(dāng)色譜柱柱壓正常，但色譜圖異常時(shí)，首先更換保護(hù)柱重新進(jìn)樣觀察色譜圖，若仍然異常則判斷為色譜柱柱效下降，需要進(jìn)行再生步驟。柱效下降在色譜圖上主要表現(xiàn)為6種，分別為峰形加寬變形、峰形變粗、嚴(yán)重拖尾、出現(xiàn)肩峰、峰尖分叉(雙峰)及峰形畸變，分別見圖1~圖6。這些異常往往導(dǎo)致無法準(zhǔn)確定量，對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性造成影響。
一般而言,前3種情形受到污染的情況比較輕微,經(jīng)過再生即可大大提高柱效。出現(xiàn)第4種峰形一般是由于色譜柱受污染較為嚴(yán)重,如果是發(fā)生在初期,通過再生清洗也能夠恢復(fù)大部分柱效,如果長時(shí)間未進(jìn)行處理,污染物與固定相已經(jīng)牢固結(jié)合,則不能通過再生進(jìn)行恢復(fù),而只能通過清除被污染的固定相來進(jìn)行修復(fù)了。出現(xiàn)第5種峰形一般是色譜柱柱頭塌陷所致。第6種情形是本應(yīng)為單一的色譜峰卻畸變?yōu)槎鄠€(gè)色譜峰,這是污染非常嚴(yán)重造成的。柱頭塌
陷和嚴(yán)重污染均不能通過再生恢復(fù)柱效,只能通過物理方法進(jìn)行修復(fù)。
再生原則如下：
( 1)反相柱的再生：采用甲醇：水=95：5( V：V) ,純甲醇、二氯甲烷等溶劑作流動(dòng)相,順次沖洗，每種流動(dòng)相經(jīng)色譜柱的量為20～30倍柱體積,然后再用相反順序沖洗色譜柱。
(2)正相柱的再生：順次用20~30倍柱體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷﹑甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱,然后再以相反的順序沖洗色譜柱。由于異丙醇的黏度較大,沖洗時(shí)應(yīng)將流速調(diào)到0. 2 mL/ min ,以免柱壓過大沖壞色譜柱。
發(fā)布于: 2023-05-22